Kromatografia likidoa osagai bakoitzaren edukia eta ezpurutasunak probatzeko metodo nagusia da lehengaietan, bitartekoetan, prestakinetan eta ontziratzeko materialetan, baina substantzia askok ez dute metodo estandarrik fidatzeko, beraz, ezinbestekoa da metodo berriak garatzea. Fase likidoko metodoen garapenean, kromatografia-zutabea likido-kromatografiaren muina da, beraz, zutabe kromatografiko egokia nola aukeratu erabakigarria da. Artikulu honetan, egileak kromatografia likidoaren zutabe bat nola aukeratu azalduko du hiru alderditatik: ideia orokorrak, gogoetak eta aplikazio-esparrua.
A.Kromatografia likidoaren zutabeak hautatzeko ideia orokorrak
1. Ebaluatu analitoaren propietate fisikoak eta kimikoak: hala nola, egitura kimikoa, disolbagarritasuna, egonkortasuna (adibidez, oxidatu/murriztu/hidrolizatu erraza den ala ez), azidotasuna eta alkalinitatea, etab., batez ere egitura kimikoa da gakoa. propietateak zehazteko faktorea, esate baterako, talde konjokatuak ultramoreen xurgapen handia eta fluoreszentzia handia du;
2. Zehaztu analisiaren helburua: bereizketa handia, zutabeen eraginkortasun handia, analisi-denbora laburra, sentsibilitate handia, presio handiko erresistentzia, zutabe-bizitza luzea, kostu baxua, etab.
- Aukeratu zutabe kromatografiko egokia: betegarri kromatografikoaren konposizioa, propietate fisikoak eta kimikoak ulertu, hala nola, partikulen tamaina, poroen tamaina, tenperatura tolerantzia, pH tolerantzia, analitoaren adsortzioa, etab.
- Kromatografia likidoko zutabeak hautatzeko gogoetak
Kapitulu honetan kromatografia-zutabe bat hautatzerakoan kontuan hartu beharreko faktoreak aztertuko dira, kromatografia-zutabearen beraren propietate fisiko eta kimikoen ikuspegitik. 2.1 Betegarrien matrizea
2.1.1 Silice-gelaren matrizea Kromatografia likidoko zutabe gehienen betegarri-matrizea silize-gela da. Betegarri mota honek purutasun handia, kostu baxua, erresistentzia mekaniko handia du, eta erraz alda daitezke taldeak (adibidez, fenil-lotura, amino-lotura, ziano-lotura, etab.), baina onartzen duen pH balioa eta tenperatura-tartea mugatuak dira: Silice gel-matrize-betegarri gehienen pH-a 2tik 8ra da, baina bereziki eraldatutako silize-gel loturiko faseen pH-a 1,5 eta 10 artekoa izan daiteke, eta pH baxuan egonkorrak diren bereziki eraldatutako silize-gelak loturiko faseak ere badaude. hala nola, Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, pH 1etik 8ra egonkorra dena; silize gel matrizearen goiko tenperatura-muga 60 ℃ izan ohi da, eta kromatografia-zutabe batzuek 40 ℃-ko tenperatura jasan dezakete pH altuan.
2.1.2 Polimero-matrizea Polimero-betegarriak gehienbat poliestireno-divinilbentzenoa edo polimetakrilatoa dira. Haien abantailak pH tarte zabala jasaten dutela da: 1 eta 14 bitarteko tartean erabil daitezke, eta tenperatura altuekiko erresistenteagoak dira (80 °C-tik gora irits daitezke). Silice-oinarritutako C18 betegarriekin alderatuta, betegarri mota honek hidrofobikotasun handiagoa du, eta polimero makroporosoa oso eraginkorra da proteinak bezalako laginak bereizteko. Bere desabantailak dira zutabearen eraginkortasuna txikiagoa dela eta erresistentzia mekanikoa silize-oinarritutako betegarriena baino ahulagoa dela. 2.2 Partikulen forma
HPLC betegarri moderno gehienak partikula esferikoak dira, baina batzuetan partikula irregularrak dira. Partikula esferikoek zutabearen presio txikiagoa, zutabearen eraginkortasun handiagoa, egonkortasuna eta bizitza luzeagoa eman ditzakete; biskositate handiko fase mugikorrak erabiltzen direnean (adibidez, azido fosforikoa) edo laginaren disoluzioa likatsua denean, partikula irregularrek azalera espezifiko handiagoa dute, bi faseen ekintza osoa lortzeko eta prezioa nahiko baxua da. 2.3 Partikulen tamaina
Partikulen tamaina zenbat eta txikiagoa izan, orduan eta handiagoa izango da zutabearen eraginkortasuna eta orduan eta bereizketa handiagoa izango da, baina orduan eta okerragoa da presio handiko erresistentzia. Gehien erabiltzen den zutabea 5 μm-ko partikula-tamainaren zutabea da; bereizketa-eskakizuna handia bada, 1,5-3 μm-ko betegarri bat hauta daiteke, eta horrek matrize konplexu batzuen eta osagai anitzeko lagin batzuen bereizketa-arazoa konpontzeko lagungarria da. UPLCk 1,5 μm-ko betegarriak erabil ditzake; 10 μm edo handiagoak diren partikula-tamainako betegarriak erabiltzen dira sarritan erdi-prestatzaile edo prestatzeko zutabeetarako. 2.4 Karbono-edukia
Karbono-edukia silize gelaren gainazalean loturiko fasearen proportzioari dagokio, azalera espezifikoarekin eta loturiko fasearen estaldurarekin lotuta dagoena. Karbono-eduki handiak zutabe-ahalmen handia eta bereizmen handia eskaintzen ditu, eta bereizketa handia behar duten lagin konplexuetarako erabiltzen da sarri, baina bi faseen arteko interakzio-denbora luzea dela eta, analisi-denbora luzea da; Karbono-eduki baxuko zutabe kromatografikoek analisi-denbora laburragoa dute eta selektibitate desberdinak erakutsi ditzakete, eta analisi azkarra behar duten lagin sinpleetarako eta fase urtsu-baldintza altuak behar dituzten laginetarako erabili ohi dira. Orokorrean, C18ren karbono-edukia %7tik %19ra bitartekoa da. 2.5 Poroen tamaina eta azalera espezifikoa
HPLC adsortzio-euskarria partikula porotsuak dira, eta interakzio gehienak poroetan gertatzen dira. Horregatik, molekulak poroetan sartu behar dira xurgatu eta bereizteko.
Poroen tamaina eta azalera espezifikoa bi kontzeptu osagarri dira. Poro txikiak azalera espezifiko handia esan nahi du, eta alderantziz. Azalera espezifiko handi batek lagin molekulen eta loturiko faseen arteko elkarrekintza areagotu dezake, atxikipena hobetu, laginaren karga eta zutabeen ahalmena areagotu eta osagai konplexuen bereizketa. Betegarri guztiz porotsuak betegarri mota honetakoak dira. Bereizketa-baldintza handiak dituztenentzat, azalera espezifiko handia duten betegarriak aukeratzea gomendatzen da; Azalera espezifiko txikiak atzera-presioa murrizten du, zutabeen eraginkortasuna hobetu eta oreka-denbora murrizten du, gradienteen analisirako egokia dena. Core-shell betegarriak betegarri mota honetakoak dira. Bereizketa bermatzeko premisa kontuan hartuta, azalera espezifiko txikiko betegarriak hautatzea gomendatzen da analisiaren eraginkortasun-eskakizun handiak dituztenentzat. 2.6 Poroen bolumena eta erresistentzia mekanikoa
Poro-bolumena, "poro-bolumena" izenez ere ezaguna, partikula unitateko hutsunearen bolumenaren tamainari dagokio. Ondo islatu dezake betegarriaren erresistentzia mekanikoa. Poro bolumen handia duten betegarrien erresistentzia mekanikoa poro bolumen txikia duten betegarriena baino apur bat ahulagoa da. 1,5 ml/g baino txikiagoa edo berdina duten poro-bolumena duten betegarriak HPLC bereizketarako erabiltzen dira gehienbat, eta 1,5 ml/g-tik gorako poro-bolumena duten betegarriak, berriz, bazterketa molekularraren kromatografiarako eta presio baxuko kromatografiarako. 2.7 Muga-tasa
Mugatzeak konposatuen eta agerian dauden silanol taldeen arteko elkarrekintzak eragindako isats-gailurrak murrizten ditu (adibidez, konposatu alkalinoen eta silanol taldeen arteko lotura ionikoa, van der Waals-en indarrak eta konposatu azidoen eta silanol taldeen arteko hidrogeno-loturak), horrela zutabearen eraginkortasuna eta gailurraren forma hobetuz. . Loturarik gabeko faseek selektibitate desberdinak sortuko dituzte loturiko faseekiko, batez ere lagin polarretan.
- Kromatografia likidoko zutabe ezberdinen aplikazio-esparrua
Kapitulu honetan kromatografia likidoko zutabe mota ezberdinen aplikazio-esparrua deskribatuko da kasu batzuen bidez.
3.1 Alderantzizko faseko C18 zutabe kromatografikoa
C18 zutabea da gehien erabiltzen den alderantzizko faseko zutabea, substantzia organiko gehienen edukia eta ezpurutasun probak bete ditzakeena, eta substantzia polar ertainei, polar ahulei eta ez-polarrei aplika dakieke. C18 zutabe kromatografikoaren mota eta zehaztapena bereizketa-eskakizun espezifikoen arabera hautatu behar dira. Esaterako, bereizketa-eskakizun handiak dituzten substantzietarako, 5 μm*4,6 mm*250 mm-ko zehaztapenak erabili ohi dira; bereizketa-matrize konplexuak eta antzeko polaritatea duten substantzietarako, 4 μm*4,6 mm*250 mm-ko zehaztapenak edo partikulen tamaina txikiagoak erabil daitezke. Adibidez, egileak 3 μm * 4,6 mm * 250 mm zutabe bat erabili zuen celecoxib APIan bi ezpurutasun genotoxiko detektatzeko. Bi substantzien bereizketa 2,9ra irits daiteke, hau da, bikaina. Horrez gain, bereizketa bermatzeko premisapean, azterketa azkarra behar bada, 10 mm edo 15 mm-ko zutabe labur bat hautatu ohi da. Adibidez, egileak LC-MS/MS erabili zuen piperaquina fosfatoaren APIan ezpurutasun genotoxiko bat detektatzeko, 3 μm * 2,1 mm * 100 mm zutabe bat erabili zen. Ezpurutasunaren eta osagai nagusiaren arteko bereizketa 2.0 izan zen, eta lagin baten detekzioa 5 minututan osa daiteke. 3.2 Alderantzizko faseko fenilo zutabea
Fenilo-zutabea alderantzizko faseko zutabe mota bat ere bada. Zutabe mota honek selektibitate handia du konposatu aromatikoetarako. C18 zutabe arruntak neurtutako konposatu aromatikoen erantzuna ahula bada, fenilo zutabea ordezkatzea pentsa dezakezu. Esate baterako, celecoxib APIa egiten ari nintzela, fabrikatzaile bereko fenilo zutabeak eta zehaztapen berdinak (guztiak 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) neurtutako osagai nagusien erantzuna C18 zutabearena baino 7 aldiz handiagoa zen. 3.3 Fase arrunteko zutabea
Alderantzizko faseko zutabearen osagarri eraginkor gisa, fase normaleko zutabea oso polar konposatuetarako egokia da. Alderantzizko faseko zutabean %90eko fase urtsua baino gehiagorekin elutzean oraindik ere oso azkarra bada, eta disolbatzaileen gailurretik hurbil eta gainjartzen bada ere, fase normaleko zutabea ordezkatzea pentsa dezakezu. Zutabe mota honek zutabe hilikoa, zutabe aminoa, zutabe zianoa, etab.
3.3.1 Zutabe hilikoa Zutabe hilikoak normalean talde hidrofiloak txertatzen ditu loturiko alkil-katean, substantzia polarekiko erantzuna hobetzeko. Zutabe mota hau egokia da azukre-substantziak aztertzeko. Egileak zutabe mota hau erabili zuen xilosaren eta haren deribatuen edukia eta erlazionatutako substantziak egiterakoan. Xilosa deribatu baten isomeroak ere ondo bereiz daitezke;
3.3.2 Amino zutabea eta ziano zutabea Amino zutabea eta ziano zutabea loturiko alkil-katearen amaieran amino eta ziano aldaketak sartzeari dagozkio, hurrenez hurren, substantzia berezien selektibitatea hobetzeko: adibidez, amino zutabea aukera ona da. azukreak, aminoazidoak, baseak eta amidak bereizteko; ziano zutabeak selektibitate hobea du hidrogenatutako eta hidrogenatu gabeko antzeko substantzia estrukturalak bereiztean, lotura konjokatuen presentzia dela eta. Amino zutabea eta ziano zutabea sarritan alda daitezke fase normalaren zutabearen eta alderantzizko fasearen zutabearen artean, baina ez da maiz aldatzea gomendatzen. 3.4 Zutabe kiral
Zutabe kiralak, izenak dioen bezala, konposatu kiralak bereizteko eta aztertzeko egokia da, batez ere farmazia arloan. Zutabe mota hau kontuan hartu daiteke alderantzizko fase konbentzionalak eta fase normaleko zutabeek isomeroen bereizketa lortu ezin dutenean. Adibidez, egileak 5 μm*4,6 mm*250 mm-ko zutabe kiral bat erabili zuen 1,2-difeniletilendiaminaren bi isomeroak bereizteko: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine eta (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamina, eta bien arteko bereizketa 2,0 ingurura iritsi zen. Hala ere, zutabe kiralak beste zutabe mota batzuk baino garestiagoak dira, normalean 1W+/pieza. Halako zutabeen beharra badago, unitateak aurrekontu nahikoa egin behar du. 3.5 Ioi-trukearen zutabea
Ioi-trukearen zutabeak egokiak dira kargatutako ioiak bereizteko eta aztertzeko, hala nola ioiak, proteinak, azido nukleikoak eta azukre-substantzia batzuk. Betegarri motaren arabera, katioi-truke-zutabeetan, anioi-truke-zutabeetan eta katioi-truke-zutabe sendoetan banatzen dira.
Katioi-trukearen zutabeen artean kaltzioan oinarritutako eta hidrogenoan oinarritutako zutabeak daude, batez ere aminoazidoak bezalako substantzia katioikoen analisirako egokiak. Esaterako, egileak kaltzio-oinarritutako zutabeak erabili zituen kaltzio glukonatoa eta kaltzio azetatoa garbiketa-soluzio batean aztertzerakoan. Bi substantziek erantzun sendoak izan zituzten λ=210nm-n, eta bereizketa-gradua 3,0era iritsi zen; egileak hidrogenoan oinarritutako zutabeak erabili zituen glukosarekin erlazionatutako substantziak aztertzerakoan. Erlazionatutako hainbat substantzia nagusiek (maltosa, maltotriosa eta fruktosa) sentsibilitate handia zuten detektagailu diferentzialen azpian, 0,5 ppm-ko detekzio-muga eta 2,0-2,5 arteko bereizketa-graduarekin.
Anion truke zutabeak azido organikoak eta halogeno ioiak bezalako substantzia anionikoak aztertzeko egokiak dira batez ere; katioi-truke-zutabe sendoek ioi-truke ahalmen eta selektibitate handiagoa dute, eta egokiak dira lagin konplexuak bereizteko eta aztertzeko.
Aurrekoa, egilearen esperientziarekin konbinatutako kromatografia likidoko hainbat zutabe arrunten moten eta aplikazio-eremuen sarrera besterik ez da. Benetako aplikazioetan beste zutabe kromatografiko mota berezi batzuk daude, hala nola, poro handiko zutabe kromatografikoak, poro txikiko zutabe kromatografikoak, afinitate-kromatografia-zutabeak, modu anitzeko zutabe kromatografikoak, errendimendu ultra-altuko kromatografia likido-zutabeak (UHPLC), fluido-kromatografia-zutabe superkritikoak. SFC), etab. Arlo ezberdinetan zeregin garrantzitsua dute. Zutabe kromatografiko mota espezifikoa hautatu behar da laginaren egitura eta propietateen, bereizketa-baldintzen eta beste helburu batzuen arabera.
Argitalpenaren ordua: 2024-06-14